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                        共聚焦顯微鏡常規樣品的制備要求

                        更新時間:2022-04-21      點擊次數:560
                          共聚焦顯微鏡是20世紀80年代發展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產品,是當今分子生物學和生命科學重要的分析儀器之一。共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎上加裝了激光掃描裝置,利用計算機進行圖像處理,從而得到細胞或組織內部微細結構的熒光圖像,在亞細胞水平上觀察諸多生理信號機細胞形態的變化,成為形態學、分子細胞生物學、神經科學、藥理學、遺傳學等科學領域中強有力的研究工具。
                          共聚焦顯微鏡樣品制備是檢測前的關鍵步驟。樣品需經熒光探劑標記(單標、雙標、三標)。
                          標本可以是固定的或活的組織,也可以是固定的或活的貼壁培養,細胞應培養在Confocal專用小培養皿或蓋玻片上,懸浮細胞,甩片或滴片后,用蓋玻片封片。樣品的Zda厚度約1~2mm,使用的蓋玻片厚度應小于0.17mm,載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間,而且表面光潔,厚度均勻,沒有明顯的干擾熒光。固定樣品常用封片劑進行封片,常用PH8.5-9的PBS配制的甘油封片。
                          常規樣品制備要求:
                          1、染料的選擇
                          由于共聚焦顯微鏡是以單一波長的激光作為光源,因此在選擇熒光染料時要根據共聚焦顯微鏡配備的激光器波長選擇,如果在同一樣品中有多種熒光染料標記,還要考慮它們的發射波長盡量不要重疊,避免串色問題。
                          2、樣品承載物的選擇
                          一般的共聚焦顯微鏡高倍物鏡均為油鏡,它的數值孔徑較小,要求鏡頭與樣品之間的工作距離不大于0.17mm,因此如果觀察樣品為貼壁細胞或組織切片,可以用普通的載玻片和蓋玻片即可。如果是懸浮細胞或懸浮粒子,可以用共聚焦顯微鏡專用的培養皿承載樣品進行觀察。
                          3、封片劑的選擇
                          如果樣品只需要觀測一次并且不是極易淬滅的熒光,可以選用一定濃度的甘油混合液封片即可。如果樣品需要放置一段時間并多次拍攝,應選用抗熒光淬滅的封片劑,以減少熒光信號丟失。


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