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                        光譜檢測-如何設定特定探針發射光的光譜檢測范圍

                        更新時間:2022-07-04      點擊次數:461



                        為了拆分多色成像的發射光譜,首先由分束器或色散元件將不同顏色的光引入到不同的方向[1],帶通濾片則能夠最大限度地減少串色,并抑制所有殘留的激發光,最終到達傳感器。在過去,常使用的濾片是普通的玻璃帶通濾片。如今,一項革命性的設計誕生了,那就是在多波段組件(探測器)中使用光度計滑塊。該設計可以極為有效地探測發射光,同時提供*可調諧性,與此同時帶來的好處是使光譜掃描成為了可能。使用白激光作為光源時,可調諧光譜檢測器是與可調諧光源光譜自由度匹配的設備。其他的光譜檢測設備使用一系列檢測元件,其波段是固定的,但它們不可調諧,靈敏度較低。

                         
                        玻濾光片
                        在以前,熒光顯微鏡總是使用玻璃濾光片作為屏障濾光片。極早期的熒光顯微鏡是透射系統,即它們在透射光下進行操作。后來該技術*被反射光束路徑(落射光)取代,入射光系統可以更好的進行激發和發射分離。由于熒光強度僅為照明的約10-4到10-10[2],所以這是一個至關重要的要求。屏障濾光片必須完成兩個任務:首先,盡量阻擋雜散光(由于樣品或光學組件中的反射,殘留激發光到達探測光路)。其次,如果樣品含有多種熒光物質(減少串色),屏障濾光片可以進一步縮小收集的光譜帶寬以增強通道信號的特異性。
                        玻璃濾光片可能由有色玻璃材料制成,有多種不同顏色。然而,有色玻璃的性能取決于其使用的化合物,除了混合各種化學品來接近所需的透射性質外,沒有其他方法來設計光譜特性。在設計上更靈活的濾光片基于多層涂層(沉積在透明玻璃上)。這種涂層或多或少為設計可見光譜內的任何帶通提供了選擇??梢杂酶鼜碗s的涂層作為多通濾片,具有三個或四個透射波段,中間有反射部分,允許多重激發和檢測。
                        盡管多層涂層技術非常先進,但此類設備的局限性在于其不可調性。為了用于多種染料之間的組合,系統必須配備一組此類濾光片,根據實驗需求,這些濾片必須通過手動或電動操作插入光路。這使得基于濾片的系統的靈活性變差,實驗效率低下。
                         
                        圖1:基于有色玻璃或干涉涂層的經典帶通濾片。要更改探測光譜區間,必須更換濾片。這需要許多濾光片和電動交換裝置(©–.)。
                        多波段分光光度計:探測器
                        還有一種*不同的方法可以從整個光譜中選擇所需波段,即使用與光譜重疊的機械設備。如果一束光穿過色散元件(棱鏡或光柵),色散后的光會根據其能量在空間上擴散,光子的能量與顏色相對應。舉一個簡單的例子,將色散后的光投影到白色表面上,即可觀察到生成的光譜。長期以來,人們用相紙來記錄和定量。而現在,人們用數碼相機芯片來查看和分析光譜分光鏡)。
                        除此以外,也可以通過在白色表面的位置插入機械狹縫,并測量透射能量來從整個光譜中選擇一個窄帶。狹縫的位置可以在光譜上移動,然后測量能量分布作為位置的函(光譜儀)。
                        不同顏色的發射光對應的能量也不同。為了檢測樣本發射光的全部能量,需要打開狹縫并將其居中,檢測窗口就會覆蓋發射光譜,并屏蔽光譜的其他部分。這種器件是一種帶通濾波器,它的優點是中心頻率和帶寬都可調諧——它包括任何(單)帶通濾波器的可能。此類器件與適當的傳感器(或)結合使用,就成為了共聚焦顯微鏡通用、靈敏的檢測器。
                        如前所述,頻帶光譜儀只能用于單通道實驗。然而,生物醫學研究中的現代熒光實驗需要同時檢測多個通道。通過串聯機械狹縫裝置可以巧妙地解決這個問題[3]。在這種多波段探測系統(后稱為“探測器")中,機械狹縫元件類似于高反射鏡。第一個通道所需的波段通過狹縫后,光譜的其余部分被引導到后續的探測器(幾乎無損失),到達這些探測器之前再次被反射鏡滑塊進行選擇。理論上,可以無限串聯這種波段探測器。由于現實原因,目前的設備最多備5個傳感器。
                        該設計的優點是效率高(狹縫透過率*,反射鏡反射率99%),所有波段的獨立自由光譜都可以進行調諧。當用白激光(可調諧光源)進行照明時,探測器是一個能合理地整合激發的高度靈活的裝置。此外,每個通道都配有專用的傳感器,可以進行獨立的電子放大和基線設置。

                        圖2:探測器采用玻璃棱鏡,具有高透射率和分光性能。通過可移動的反射鏡滑塊將光譜分成多個波段。這使得光譜可以分成任何可能的子光譜集,然后被檢測器通道測。。
                         
                        其他方法
                        繼檢測器后,其他的一些設計相繼問世,旨在配合多波段方法的優勢。其中之一陣列檢測器,通常是多陽極光電倍增管,將光譜投射到其上[4,5]。雖然這些設備可以更簡單地放大檢測信號,但它們有明顯的缺點:由于必須對不同部分進行機械分離,使用多陽極陣列會使得收集的光子減少。它們受到光電串擾的影響,無法單獨調整放大功率。這些波段本質上是固定的,即不可調諧,因此無法適用于當今使用的熒光染料的各種發射特性——未來發射特性會越來越復雜。這些設備不輸出分配給單個發射種類的信號,而只是輸出光譜的固定部分。因此,它們必須要通過分解算法對記錄的數據進行后處理,以獲得有意義的通道數據。(使用探測器,將信號分配給不同發射種類,此時分離可以清除殘留重疊。)
                        陣列探測器還強制要求發射光具備線性色散。因此無法在配備了陣列探測器的系統中使用棱鏡,所以只能使用光柵,但其性能具有重大缺陷。第一,光柵輸出不均一,衍射的最大值位于閃耀波長處。因此,在較長和較短波長下收集的數據低于真實值。第二,光柵對偏振的依賴性很強,對非偏振光(這是生物熒光發射的典型情況)的衍射效率會降低到50-70%左右(針對表現好的顏色)。因此需要使用其他光學元件彌補該缺陷[6]。光柵的第三個問題是:輸入能量不僅在單一光譜中釋放,而且還釋放進入了0階和更高階的散射光中去。這降低了所有光柵的整體衍射效率。同樣也引入了其他更多的光學設備來解決這個問題[7]。
                        這些設備都是基于記錄光譜的理念而設計的。然而,除非在非常罕見的情況下,熒光成像不需要記錄光譜。熒光成像需要重新計算低效獲得的光譜以提供有意義的染料信息。探測器不會受到高階損耗的影響,也不會受到偏振相關的影響。它提供*可調的檢測帶,并具有單獨的放大功能。它可以進行線性分解處理,這是一個額外的優勢—意味著同時也可以在高分辨率下記錄光譜[8]。因此將可調白激光與可調檢測設備進行組合是非合理的。
                         
                        圖3:單點探測器(探測器)可以調整樣品中各種染料發射的動態差異。與多陽極陣列探測器相反,兩個探測窗口都是可調的,并且可以單獨調整動態范圍。

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