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                        【激光顯微切割小課堂】激光顯微切割實現高質量的RNA提取

                        更新時間:2023-03-20      點擊次數:356

                        比較未經處理的天然小鼠腦組織以及經固定并染色的組織在使用紫外激光切片后的RNA質量


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                        本文介紹了樣品制備過程和紫外激光顯微切片(UV LMD)對小鼠腦組織冷凍切片RNA質量的影響。為在提取RNA時獲取良好的結果,從高品質組織開始并在處理前后檢查RNA質量至關重要。RNA完整性指數(RIN)以1到10的等級標準來顯示樣品質量。簡言之,RIN數值越高,RNA質量越高。這項研究結果表明,可以利用紫外激光顯微切片技術,可以從單個組織細胞中獲取品質穩定的RNA。



                        評估不同制備方法

                        對于小腦組織切片RNA質量的影響  




                        由于自身的不穩定性,RNA通常比DNA更難處理。RNA并不具備DNA穩定的雙螺旋結構。為了在處理RNA時保證優良品質,必須從優質材料開始,并在處理前后進行特別仔細的質量控制。所謂的RNA完整性指數(RIN)是RNA質量的指標[1]。根據1到10的評價標準,RIN值為1表示RNA已wanquan分解,RIN值為10則表示RNA完好無損。簡言之,RIN數值越高,RNA質量越高。只要可能,應始終選用具有高RIN值的材料。


                        固定并染色樣品制備方法的影響以及后續紫外激光顯微切片對于小鼠腦組織切片(事后檢查)的影響描述如下。將冷凍保存且未經處理的腦組織切片的RIN值與采用標準方案處理并分離的切片進行比較。圖1顯示了從冷凍切片到RIN分析的樣品制備工作流程。




                        圖片

                        圖1:小鼠腦組織從冷凍切片到激光顯微切片再到RIN分析的樣品處理流程。




                        冷凍切片,然后進行染色并固定

                        為了比較未經處理的組織樣本與固定和染色的組織樣本,使用3組已知RIN完整指數(RIN)的冷凍保存小鼠腦組織。在-80°C冷凍保存后,將它們轉移到冷凍切片刀處,并在-35°C下孵育45分鐘,然后將組織在-18°C下平衡30分鐘,接著在-18°C下通過冷凍切片將其切成12µm的切片。小鼠腦組織切片分為兩組,并按以下方式處理。一個是對照組,直接冷凍在-80°C,另一組則進行無RNase的紫外線處理PEN載玻片。這需要通過在室溫下短暫解凍切片并在冷卻至-20°C的75%乙醇溶液中固定2分鐘來,然后,立即用幾滴無菌過濾的甲酚紫(CV)染料溶液(含5%甲酚紫的純乙醇溶液)并輕輕來回移動孵育45秒。


                        在染色過程中,染料溶液會短暫排除,載玻片浸入一系列濃度遞增(75%、95%和100%)的乙醇溶液中,每次4秒鐘,最后固定在100%的乙醇溶液中(試驗組)。完成固定和染色程序之后,將載玻片在裝有硅凝膠的干燥室中放置45分鐘,然后保存在-80°C的干燥箱中,等待進行激光顯微切片。




                        紫外激光顯微切片

                        固定和染色之后,相關組織采用溫和且無污染的紫外激光顯微切片(UV LMD)進行分離[2]。這需要使用顯微鏡的10倍物鏡對組織進行標記并分割成多個矩形,然后使用足夠能量的激光束通過“Draw + Cut"(繪圖切割)模式進行wanquan消融。切割物收集在0.5ml的無RNase蓋帽中,以便對RNA內容進行提純。這些會保存在–80°C的環境下,等待進行RNA分離。




                        RNA平行分離

                        兩組樣品,即保存在在 –80°C下未經處理的樣品,以及經固定、染色和激光顯微切片處理的樣品,接受平行解凍并同時用相同的試劑處理。按照制造商的說明使用Qiagen的RNase Mini Kit®進行提純。提純的RNA使用30µl的無RNase水洗脫到新的無RNase試管中。




                        比較關系到RNA質量的RIN值

                        為了比較天然冷凍組織切片與經過CV染色、乙醇固定、激光顯微切割的組織切片的RNA質量,將來自每個不同處理樣品的RNA放入同一RNA納米芯片(安捷倫生物分析儀)。RNA納米芯片通過毛細管凝膠電泳分離RNA樣品,并根據樣品在芯片上的移動方式對樣品質量進行分級。如前所述,RNA質量表示為RIN值,其中10表示wanquan完整的RNA,1表示wanquan分解的RNA。


                        此處進行的RIN分析(圖2中的樣品測量)表明,來自直接冷凍的天然組織的RNA樣品的RIN值與根據UV-LMD標準方案處理的RNA樣品的RIN值沒有太大差異。




                        RNA沉淀

                        緊接著將分離的RNA樣品分成兩組,每組中有一半的樣品進行沉淀。在RNA沉淀后,根據參考文件3中提供的說明,來自天然冷凍組織的已沉淀樣品的RNA的RIN值略低于來自經過CV染色、EtOH固定、UV-LMD處理的樣品的RNA的RIN值[3]。這種差異可能來自沉淀混合物的poly-I,因為其中一些短鏈RNA分子在芯片中進行RIN測量時會被提純并與其他RNA一起檢測,并計入分解部分。在qPCR 反應中,poly-I沒有產生負面影響。因此,經過固定、染色以及紫外激光顯微切片的腦組織切片有沒有進行RNA沉淀,都不會影響其質量。圖2顯示了未經處理的天然小鼠腦組織切片和經過固定并染色的小鼠腦組織切片在RNA質量方面的比較結果

                        圖片

                        圖2:比較未經處理的天然小鼠腦組織切片和經固定并染色的小鼠腦組織切片的RNA質量:本例顯示了從天然冷凍組織(天然)和經CV染色、EtOH固定和UV-LMD切片處理的相同小鼠腦組織中分離出的RNA樣品,在RNA沉淀前后的虛擬RNA凝膠圖(左)和安捷倫RNA芯片的相關電泳圖(右)。電泳圖來自熒光單位 (FU) 隨著時間的推移(以秒[s]為單位)的結果[4,5]。



                        結 論


                        總而言之,實驗表明使用所述方法進行紫外激光顯微切割[2],不會顯著影響冷凍保存的腦組織的RNA質量。這種技術提供了一種合理的樣品制備方法,并實現了單個細胞的非破壞性分離,從而獲得質量一致的RNA。


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                        Leica LMD6 & LMD7激光顯微切割



                        References:(上下滑動查看更多)

                        1.A. Schroeder, O. Mueller, S. Stocker, R. Salowsky, M. Michael, M. Gassmann, S. Lightfoot, W. Menzel, M. Granzow, T. Ragg, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements, BMC Molecular Biology (2006) vol. 7, iss. 1, art. 3, DOI: 10.1186/1471-2199-7-3.

                        2.J. Gründemann, F. Schlaudraff, B. Liss, UV-Laser Microdissection and mRNA Expression Analysis of Individual Neurons from Postmortem Parkinson’s Disease Brains. In: Murray, G. (eds) Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology, vol. 755 (Humana Press, 2011), pp. 363-374, DOI: 10.1007/978-1-61779-163-5_30.

                        3.B. Liss, Improved quantitative real‐time RT–PCR for expression profiling of individual cells, Nucleic Acids Research (2002) vol. 30, iss. 17, e89, DOI: 10.1093/nar/gnf088.

                        4.Schlaudraff F, Gründemann J, Fauler M, Dragecivic E, Hardy J, and Liss B, Orchestrated increase of dopamine and PARK mRNAs but not miR-133b in dopamine neurons in Parkinson’s disease, Neurobiology of Aging (2014) vol. 35, iss. 10, pp. 2302-2315, DOI: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.03.016.

                        5.Duda J, Fauler M, Gründemann J, Liss B, Cell-Specific RNA Quantification in Human SN DA Neurons from Heterogeneous Post-mortem Midbrain Samples by UV-Laser Microdissection and RT-qPCR, Methods Mol. Biol. (2018) vol. 1723, pp. 335-360, DOI: 10.1007/978-1-4939-7558-7_19.



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