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                        如何巧妙使用熒光壽命

                        更新時間:2023-04-10      點擊次數:422

                        熒光壽命的概念

                        熒光壽命是熒光分子在激發態停留的時間,這個時間可以反映熒光分子的內在屬性和所處的微環境,是一個很有用的工具。以往,熒光壽命的測量和計算是件非常復雜和耗時的工作,只有少數專業的科學家關注和使用該工具。最近幾年,隨著新技術的發展,熒光壽命數據的獲得越來越容易,也被更多的生命科學領域科學家來利用熒光壽命進行實驗設計德國馬普醫學研究所的Kai Johnsson研究組長期致力于開發新的蛋白質標記技術,近期,他們利用熒光壽命來輔助開發新的蛋白標記,在2021年4月在BioRxiv上刊發了題為“

                        HaloTag9: an engineered protein tag to improve fluorophore performance"的研究論文。

                        俗話說巧婦難為無米之炊,科學實驗第一步就是拿到好的材料。作者鎖定了常用的標簽蛋白Halo7,將其改造成了壽命更長的Halo9。

                        Halo9的前世今生:

                        Halo7標簽蛋白由于其分子量小、易于表達、無生物毒性等優點被廣泛應用在原核和真核表達系統中。將Halo7標簽蛋白與目的蛋白重組后,用帶有氯代烷烴的熒光配基與Halo蛋白發生脫鹵素反應形成酰胺鍵共價結合,即可實現熒光配基對目的蛋白的標記(圖1A和1B)。


                        該實驗室用點飽和突變的方式對Halo7進行了改造,篩選得到的Halo9與熒光配基MaP618結合后,熒光強度較Halo7增加了近百分之四十。更為重要的是熒光壽命發生了改變,從3.1ns(HaloTag7-MaP618)提升到3.7ns(HaloTag9-MaP618)(圖1D)。




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                        圖1 Halo標簽蛋白工作原理及改造示意圖

                        材料拿到之后,我們看下作者是如何利用熒光壽命技術對這來之不易的材料玩出新花樣的吧。
                        花樣一:根據熒光壽命進行光譜之外的拆分

                        Halo7與Halo9聯用實現單通道多色成像

                        作者構建了H2B-HaloTag7與 Tommo20-HaloTag9融合表達細胞系,使用MaP555-CA來同時標記HaloTag7與HaloTag9,用MaP555-Actin來標記F-actin, 而MaP555-Actin與MaP555光譜相同,所以系統僅采用一個光譜通道完成圖像采集,再通過Phasor根據熒光壽命拆分出三個通道,分別是MaP555-CA-H2B-HaloTag7標記的細胞核、MaP555-CA-Tommo20-HaloTag9標記的線粒體和MaP555-Actin標記的細胞骨架(圖2)。


                        這樣設計的優勢在哪里呢?傳統的多色成像實驗根據光譜差異來設計,會有串色等限制,而且需要多次采集圖像,會造成樣品的光損傷。通過熒光壽命來進行成像,僅需要拍攝一次就完成圖像采集,不僅減少了成像時間,而且降低了激光對樣品的損傷。



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                        圖2 單通道三色熒光成像

                        綠色,H2B-Halo7標記細胞核;紫色,Tomm20-Halo9標記線粒體;藍色,MaP555-Actin標記微絲。Halo7與Halo9配基均為MaP555-CA。Ex:550,Em:570-620。



                        花樣二:利用熒光壽命進行超高分辨成像——TauSTED

                        H2B-HaloTag7與 Tommo20-HaloTag9融合表達細胞系構建成功后,作者對該細胞做了STED超高分辨成像。由于只用了一個染料MaP555去同時標記HaloTag7與HaloTag9, STED成像時僅需要一次depletion過程就完成圖像采集。后期通過Phasor云圖將H2B和Tomm20的未受受激輻射的長壽命的光子分離出來,即得到背景更純凈的雙色STED圖像(圖3)。




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                        單通道TauSTED雙色成像

                        第一行,共聚焦成像結果;第二行,TauSTED成像結果;第三行 ,共聚焦與TauSTED成像Phasor圖對比。綠色,H2B-Halo7標記細胞核;紫色,Tomm20-Halo9標記線粒體,配基均為MaP618-CA。Ex:615,Em:630-760。



                        技術盤點——TauSTED

                        STED技術通過一束環形的STED激光來干涉熒光衍射環的外圈發生受激輻射從而產生擦除效果,從而突破衍射極限實現超高分辨率成像。TauSTED技術創造性地將STED與熒光壽命技術結合,XY分辨率可達到30nm,獲得高分辨率的同時可顯著降低STED激光強度保護樣本。TauSTED特別適合應用于組織和細胞內微小結構和物質的觀察,如膜蛋白與膜微結構域、細胞器內部的微小結構觀察、細胞骨架結構、蛋白復合物等。




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                        TauSTED成像對比

                        從左往右,傳統共聚焦成像,2%STED激光強度傳統STED成像,2%STED激光強度TauSTED成像。



                        花樣三利用熒光壽命技術改造Biosensor

                        Fucci(Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator)是一種監測細胞周期的biosensor。Fucci(CA) 將細胞周期依賴性的降解片段hCdt與hGem分別連接綠色和紅色熒光蛋白,根據得到的兩種熒光蛋白的強度比例來區分四種不同的細胞周期G1期、S期、G2期和M期。作者將此biosensor中的兩種熒光蛋白分別用HaloTag7和HaloTag9進行置換,根據此兩種Tag熒光壽命的不同來指示細胞周期,構建了基于熒光壽命成像的Fucci(CA) -LT。


                        作者使用TauSense工具測得HT7-hGem的AAT(Average photon arrival time,平均光子到達時間)較短,用于指示S期,HT9-hCdt的AAT較長,用于指示G1期,而G2和M期混雜了兩種成分,測得的AAT處于中間水平(圖5A)。由于HaloTag可以用不同的染料進行標記,Fucci(CA)-LT構建成功之后,實驗人員可以任意更換與HaloTag搭配的不同顏色的探針,靈活性更強。此外,作者還將TauSense測得的圖與FastFLIM測得的圖進行了對比(圖5B),結果顯示兩種測量方法的一致性很高。對比基于光譜的Fucci(CA),基于熒光壽命的Fucci(CA)-LT只需要一個成像通道就完成實驗,光毒性較Fucci(CA)降低了一半,在長時間活細胞成像中更具有優勢(視頻1)。




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                        5 基于熒光壽命構建Fucci(CA)biosensor,追蹤細胞周期

                        A,Fucci(CA)-LT工作原理示意;B,Fucci(CA)-LT 指示細胞周期,TauContrast與FastFLIM測量結果對比,無明顯差異。



                         

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                        視頻1 TauSense長時程(24小時)活細胞成像

                        技術盤點——TauSense
                        TauSense用平均光子到達時間(Average photon arrival time,AAT)來指示熒光壽命,使用簡單,方便快捷,不需要進行參數調節,幫助您快速挖掘樣品熒光壽命信息。它包含三個子工具,TauContrast可以一鍵獲取樣品的熒光強度信息和壽命信息,用于監測細胞周期變化、離子濃度的變化、組織的代謝變化等;TauGating根據AAT的長短來設置時間窗口,可以將樣品中短壽命的自發熒光、雜散光等去除掉;TauSeparation基于AAT的區別將檢測到的信號進行拆分,即使所用的染料發射光譜*重合,TauSeparation也能將其拆分成多個通道。

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                        TauGating去除擬南芥葉片細胞壁自發熒光

                        左圖:普通模式成像;右圖:TauGating成像。紅色:葉綠體;綠色:線粒體;門控窗口:0.3-12ns。




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                        TauSeparation技術用于NE-115細胞雙通道四色成像

                        左圖:灰色,NUC Red(細胞核)和SiR-tubulin(微管);黃色,Act-mNeoGreen(微絲)和MitoTracker Green(線粒體),光譜兩兩串色不可拆分。右圖:藍色,NUC Red(細胞核);洋紅色,SiR-tublin(微管);紅色,Act-mNeonGreen(微絲);綠色,MitoTracker Green(線粒體)。



                        總結  
                        本論文通過改造HaloTag7得到了壽命更長的HaloTag9,HaloTag7與HaloTag9聯合使用,僅需要一種染料標記即可實現多色成像。用此種方法進行TauSTED成像時,可通過phasor將熒光壽命進行拆分,一次depletion過程完成雙色STED成像,減少了光損傷。用此方法構建的Fucci(CA)-LT biosensor監測細胞周期,可以自由選擇熒光配基的種類,應用更靈活。

                        科研小靈感:
                        標簽蛋白何其多,biosensor何其多。選取一個切入點,開動腦筋改一改,熒光壽命技術用起來,說不定就成功了呢?

                        參考文獻

                        【1】Deo, C. et al. The HaloTag as a general scaffold for far-red tunable chemigenetic indicators. Nat. Chem. Biol. (2021). doi:10.1038/s41589-021-00775-w

                        【2】Digman, M. A., Caiolfa, V. R., Zamai, M. & Gratton, E. The phasor approach to fluorescence lifetime imaging analysis.

                        Biophys. J. 94, L14–L16 (2008).

                        【3】Roberti, M. J.

                        et al. TauSense: a fluorescence lifetime-based tool set for everyday imaging. Nat. Methods (2020).

                        【4】Shirmanova, M. V et al. FUCCI-Red: a single-color cell cycle indicator for fluorescence lifetime imaging. Cell. Mol. Life Sci. (2021). doi:10.1007/s00018-020-03712-7


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