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                        用于病毒復制研究的正置熒光顯微鏡

                        更新時間:2023-05-11      點擊次數:319

                        用于病毒復制研究的正置熒光顯微鏡
                        冠狀病毒2致重度急性呼吸綜合征(SARS-CoV-2)出現于2019年末,并快速傳播全球。由于其大面積的影響,研究人員對病毒的性質進行了深入的研究以期最終阻止大流行。一個重要的方面是病毒如何在宿主細胞中復制。Ogando及其同事的研究已經揭示了SARS-CoV-2的復制動力學、適應能力和細胞病理學。他們的工具之一是用熒光顯微鏡觀察SARS-CoV-2感染的VeroE6細胞。通過使用前一段時間產生的抗SARS-CoV(2002)的抗體,他們發現了與SARS-CoV-2的強烈交叉反應。因此,他們建立了一種通過免疫熒光顯微成像研究SARS-CoV-2復制的工具。

                           
                        用于病毒觀察的顯微鏡
                        病毒可以借助幾種顯微鏡技術進行研究。根據顯微鏡的放大倍數和分辨率,可以在組織水平、細胞水平或病毒粒子水平進行觀察(圖1)。通常,病毒粒子本身只能通過電子顯微鏡或超分辨顯微鏡來分辨。在細胞水平上,病毒大多借助先進的寬場熒光或共焦顯微鏡進行觀察。在組織中,明場顯微鏡或基本的寬場熒光顯微鏡足以用于病毒研究。但是顯微技術的鑒別并不是嚴格的。

                        光學數字圖像處理工具如ICC光學圖像解析等可以幫助提高背景信號比,減少離焦模糊。相關的對比度增強可以揭示顯微圖像中的附加信息。

                        圖1: 病毒可從組織到單個病毒顆粒的不同層面進行觀察。對于這種方法,需要明顯的放大倍數和分辨率。因此,研究人員選擇了一種適合他們需要的顯微鏡技術。

                        圖1: 病毒可從組織到單個病毒顆粒的不同層面進行觀察。對于這種方法,需要明顯的放大倍數和分辨率。因此,研究人員選擇了一種適合他們需要的顯微鏡技術。

                        病毒蛋白的免疫熒光檢查
                        在測序技術、生物信息學和電子顯微鏡中,Ogando等人通過熒光顯微鏡分析了感染細胞:VeroE6細胞生長在玻璃蓋玻片上,感染SARS-CoV-2,并用多聚甲醛固定。然后,用事先暴露于SARS-CoV的兔子或小鼠的抗血清孵育細胞(圖2)。用熒光標示的二級抗體檢測與veroe6細胞SARS-CoV-2結構結合的SARS-CoV源性抗體。此外,細胞核用Hoechst染色。用DM6 B直立熒光顯微鏡進行熒光成像。

                        圖2: Ogando等人的一項實驗涉及使用免疫熒光顯微鏡對VeroE6細胞成像。在2002/2003年SARS爆發期間,他們大體上探索了在兔子身上制備抗SARS-CoV抗血清的潛力。他們使用不同的兔抗血清作為第一組抗體。然后,用第二組熒光抗體標記這些兔抗血清。隨后,用DM6 B顯微鏡進行熒光顯微鏡檢查。

                        圖2: Ogando等人的一項實驗涉及使用免疫熒光顯微鏡對VeroE6細胞成像。在2002/2003年SARS爆發期間,他們大體上探索了在兔子身上制備抗SARS-CoV抗血清的潛力。他們使用不同的兔抗血清作為第一組抗體。然后,用第二組熒光抗體標記這些兔抗血清。隨后,用DM6 B顯微鏡進行熒光顯微鏡檢查。
                        SARS-CoV抗血清與SARS-CoV-2的交叉反應

                        免疫熒光顯微鏡顯示,許多SARS-CoV抗血清在SAR-SCoV-2感染細胞(病毒蛋白nsp3、nsp4、nsp5、nsp8、nsp9、nsp13、nsp15、N、M)中具有交叉反應性。這一事實意味著,針對SARS-CoV產生的抗血清也導致SARS-CoV-2感染細胞的特征性熒光染色(圖3)。nsps出現在感染細胞的核周區,而N蛋白則分布在胞漿中。在高爾基體中檢測到M蛋白。

                        圖3: SARS-CoV-2感染VeroE6細胞后用兔SARS-CoV抗血清處理的免疫熒光顯微鏡。Nsps位于細胞核附近,M蛋白位于高爾基體??筪sRNA抗體用于標記病毒RNA合成的復制中間產物。細胞核用Hoechst染色。(a)和(b)的比例尺為25 μm;(c)、(d)和(e)的比例尺為100 μm。圖片來源:Ogando et al., Journal of General Virology (DOI 10.1099/jgv.0.001453)。

                        圖3: SARS-CoV-2感染VeroE6細胞后用兔SARS-CoV抗血清處理的免疫熒光顯微鏡。Nsps位于細胞核附近,M蛋白位于高爾基體??筪sRNA抗體用于標記病毒RNA合成的復制中間產物。細胞核用Hoechst染色。(a)和(b)的比例尺為25 μm;(c)、(d)和(e)的比例尺為100 μm。圖片來源:Ogando et al., Journal of General Virology (DOI 10.1099/jgv.0.001453)。

                        正置熒光顯微鏡在病毒學研究中的潛力
                        Ogando等人的研究中描述的交叉反應抗血清將是特征性SARS-CoV-2復制周期的實用工具。這個工具反過來能使研究人員能夠確定復制抑制劑的潛在目標。

                        一個相對簡單的實驗裝置-免疫熒光顯微鏡-足以得出病毒復制周期的結論。因為這種方法細胞生長在蓋玻片上,并安裝在玻片上,所以正置熒光顯微鏡是一種實用的解決方案。配備有電動載物臺和采用寬視野(FOV)的自動化掃片模塊幫助用戶快速獲取全玻片的圖像概覽。如果單視野快拍就能滿足需求,則機械式載物臺是更合理的選擇。

                        閱讀原版刊物
                        冠狀病毒SARS-Cov-2在Vero E6細胞中復制:復制動力學、快速自適應性和細胞病理學
                        NS Ogando, TJ Dalebout, JC Zevenhoven-Dobbe, RWAL Limpens, Y van der Meer, L Clay, J
                        Druce, JJC de Vries, M Kikkert, M Bárcena, I Sidorov, EJ Snijder
                        Microbiology Society, 22 June 2020; doi.org/10.1099/jgv.0.001453

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