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                        徠卡顯微鏡的活細胞成像技術

                        更新時間:2023-06-05      點擊次數:420

                        了解復雜且快速變化的細胞動力學是深入探索生物進程的重要一步。因此,現代生命科學研究越來越需要關注于在分子水平上實時發生的生理事件。

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                        觀察和分析活細胞時面臨的挑戰
                        在固定細胞或組織中,獲取樣品“分子狀態"的信息已是一項艱巨的任務。如果需要獲取實時信息,,就必須盡可能在實驗過程中保證細胞自然地運行生理機制,因此將加大實驗的困難程度。此外,由于很多生理過程的持續時間僅有幾秒甚至幾毫秒(例如細胞內離子水平的變化),必須在相對較短的時間內采集大量信息。
                        滿足這些挑戰性需求的一種方法是采用被統稱為活細胞成像的光學技術?;罴毎上窨裳芯炕罴毎械膶崟r動態生理過程,而非提供細胞當前狀態的一幅“快照"。它把快照轉變成了電影?;罴毎上窨商峁﹩蝹€細胞、細胞內網絡(原位)甚至整個生物體(體內)中動態發生分子事件的空間和時間信息。這些特性讓活細胞成像成為了研究細胞生物學、癌癥、發育生物學和神經科學中動態生理過程的必要技術。
                        近年來,電子學、光學和生物化學的迅速發展,使得科學家們更輕松的實現活細胞成像。如今的活細胞成像方法使用優化的顯微鏡、專用光源、高速相機、高靈敏度探測器和特異性的熒光標記物,可同時提供技術成熟且仍具有創新性的全套解決方案,滿足在分子水平上對單細胞或整個細胞網絡進行實時研究的挑戰性需求。
                        使用線粒體標記物(MitoRed®)和熒光鈣染料(Fluo-4)對細胞進行活細胞成像

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                        圖1:熒光鈣染料Fluo-4標記的睪丸支持細胞的原代培養。鈣染料的位置類似于表征細胞內的鈣分布。

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                        圖2:線粒體標記物MitoRed®染色的睪丸支持細胞的原代培養。

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                        圖3:圖1和圖2的疊加。觀察鈣斑和線粒體的共定位情況。

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                        圖4:睪丸支持細胞的DIC圖像。
                         
                        使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像軟件獲取的圖像。由德國亞琛工業大學生物II研究所化學感知系Sophie Veitinger博士提供。(地址:德國馬爾堡菲利普斯大學細胞生物學和細胞病理學研究所)
                        對應刊物(非圖片來源):
                         
                        活細胞成像中的常見問題
                        活細胞成像通常適用于培養的細胞系(例如HEK細胞、HeLa細胞)、原代細胞(例如皮膚細胞、神經細胞)、急性制備的組織切片(例如腦切片)或整個器官或生物體。因為細胞被帶出其原本“自然"的培養環境并會受到光毒性的影響,所以在實驗過程中的首要任務是保持細胞的健康狀態。
                         
                        細胞外溶液
                        不同類型的人工細胞外溶液(林格氏液、人工腦脊液(ACSF))和培養基(例如Leibovitz L-15)用于為細胞提供維持其生理功能所必需離子和其他輔助因子。用于活細胞成像的培養基成分包括從極簡單的“含鹽"溶液(例如林格氏液)到非常復雜的混合物(例如Leibovitz L-15),種類繁多。
                        但所有溶液都有一個共同點,即都包含pH緩沖液,因為暴露在環境中之后,會顯著改變培養的pH(通常pH 7.2.-7.4)。在很多細胞外溶液中,pH緩沖液通過添加10–20 mM兩性離子有機化學品HEPES(2-[4-1-基]乙磺酸)來實現。但對于很多細胞來說,細胞外溶液不能用HEPES或其他化學緩沖液(例如MOPS、TES),因為培養基中缺乏pH緩沖碳酸氫鹽會對細胞造成傷害。要解決該問題,必須將二氧化碳輸送到細胞外溶液中(二氧化碳與細胞外溶液接觸時,會轉化為碳酸氫鹽)。這可以通過兩種方式實現:一種是不斷輸送氣態二氧化碳(通常以碳化物的形式:95%的氧氣和5%的二氧化碳)到細胞外溶液中,并不斷對細胞進行換液。這種方法通常用于代謝周轉率高于細胞增殖的切片制備。
                        另一種常見的方法是將細胞保存在可調節培養環境氣體濃度和溫度(在很多情況下)的培養室中。在此類培養物中持續供應5-7%的二氧化碳氣體,并且可以嚴格控制溫度。必須根據使用的樣品類型和實驗的持續時間,來確定化學緩沖的細胞外溶液是否足以使細胞保持良好狀態,或者是否需要輸送二氧化碳甚至使用培養小室。在很多情況下,化學緩沖溶液即可滿足細胞培養和短時實驗的要求。,因為急性切片代謝周轉率要高得多,通常需要足夠的二氧化碳供應。但對于很多細胞類型和長時間成像實驗,必須使用培養小室。
                         
                        光毒性
                        使用熒光染料進行活細胞成像的另一個問題是:激光或高強度電弧放電燈的入射光會損害細胞,即所謂的光毒性。光毒性主要在合成熒光染料被激發時發生。熒光染料被激發后,它們將與分子氧發生反應并產生自由基。為避免光毒性,必須選擇盡可能低的光強度和盡可能短的激發持續時間,以將入射高能光劑量保持在盡可能低的水平。在實驗設計過程中,還必須考慮實驗的持續時間。長時間實驗中,通常不需要高幀速率。因此,圖像采集的周期頻率通??梢詮睦缑棵?0多幀降低到每秒1幀甚至更低。這將顯著降低樣品上的入射光劑量,從而大幅降低光毒性。
                        對于低強度熒光信號成像,可以考慮更改圖像采集條件設置,比如在大多數情況下,通過將相機功能用作像素合并或提高增益,甚至使用特殊的高靈敏度相機(例如EM-CCD相機)進行成像。這樣可以在不增加激發持續時間或光強度的情況下實現更好的信噪比和信號質量,而這兩者都會導致更高的光毒性。此外,選擇具有長激發波長的熒光基團也可降低光毒性,因為與具有短激發波長的熒光基團相比,傳遞給樣品的能量更低。熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白(GFP))的光敏位點位于被多肽包膜覆蓋的蛋白質內部,因此通常沒有光毒性。
                         
                        漂移
                        此外,在長時間的活細胞成像實驗中,很可能發生焦面漂移的問題,,??梢允褂门鋫溆熊浖蛴布刂谱詣訉沟某上駜x器來避免這種情況。

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                        圖5:接種了豇豆花葉病毒(CPMV)的豇豆初生葉(Vigna unguiculata "California Blackeye"),在病毒RNA 2中的運動蛋白(MP)和衣殼蛋白(CP)之間的插入GFP基因。GFP以游離蛋白的形式大量表達(因此未融合于MP或CP),并且可以定位在受感染的表皮和葉肉細胞的細胞質和細胞核中。由荷蘭瓦赫寧根農業大學,生物分子科學部門分子生物學實驗室的Joan Wellink博士及植物科學部門病毒學實驗室的Jan van Lent博士提供。
                         

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                        視頻1:用DIOC6染色的活洋蔥球細胞,同時進行透射光檢測;使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP2 AOBS RS拍攝,63倍物鏡,1.5倍變焦,2倍線平均,掃描分辨率512 x 265,速度每秒4.7幀。

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                        視頻2:用表達GFP融合蛋白的構建體瞬時轉染的COS細胞。細胞溶質蛋白在細胞中呈針狀分布。3D堆棧(10.14 µm,14層切)每5秒記錄一次,,持續10分鐘。本視頻使用了堆棧的最大投影。512 x 512像素,雙向掃描,變焦2倍,物鏡HCX APO L U-V-I 63.0 x 0.90 W UV。由法國伊爾基希細胞生物學研究所成像中心Jocelyn Laporte,提供。
                         
                        用于活細胞成像的方法
                        可應用于活細胞成像的寬場和共聚焦顯微技術的范圍也非常廣泛。通常,使用復式顯微鏡和反差對比方法(例如相差和微分干涉相差(DIC)),隨時間觀察細胞的生長、聚集或運動過程。此外,通常使用體視顯微鏡或宏觀鏡對大型標本(例如發育中的斑馬魚胚胎)進行延時成像。在過去數十年中,先進熒光技術變得越來越重要。共聚焦顯微鏡應用的迅速增加,使生物研究的視角從平面向三維立體轉變。


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