<meter id="r9lrp"></meter>

    <delect id="r9lrp"><pre id="r9lrp"></pre></delect>
        <menuitem id="r9lrp"><em id="r9lrp"><meter id="r9lrp"></meter></em></menuitem>
          <menuitem id="r9lrp"></menuitem>
            <ins id="r9lrp"><video id="r9lrp"></video></ins>

              <font id="r9lrp"></font>

                  
                  
                    <ins id="r9lrp"><em id="r9lrp"></em></ins>

                    <dfn id="r9lrp"></dfn>
                        <font id="r9lrp"></font>

                        捕捉神經遞質受體和離子通道

                        更新時間:2023-08-07      點擊次數:242

                        利用高分辨率顯微技術確定膜蛋白的位置



                        中樞神經系統中的神經遞質受體和離子通道位于神經元突觸前后的膜室和突觸外膜室內。這些蛋白質的激活對突觸融合和調節遞質釋放的影響取決于它們相對于突觸的精確位置,以及分子在細胞微隔室的密度大小和耦合效應。因此,對膜約束受體和離子通道進行高分辨率的定性與定量的可視化研究,對于理解它們在細胞通訊中發揮的作用至關重要。




                        神經網絡中的分子動力學

                        神經系統的學習能力和環境適應能力表明,從動力學角度而言,神經元具有改變其連接數量、類型和強度的基本能力。這些連接被稱為突觸,是突觸后神經元和突觸前末梢之間高度有序的接點。特化的突觸膜包含大量分子,如受體、離子通道和相關結構蛋白,其中精確的亞細胞結構對其發揮正常功能具有促進作用。大量研究表明,這些蛋白質的位置和它們相對于突觸的位置都會對其功能作用產生實質性影響。神經遞質受體位于神經元突觸后區的突觸膜上,直接接觸釋放的神經遞質。


                        因此,受體瞬時激活,迅速產生突觸后反應,與突觸前動作電位之間具有精確的鎖時關系。相反,位于突觸外質膜上的受體,遠離突觸點,被溢出的神經遞質激活,產生抑制性電導,該電導與單個突觸前動作電位之間并不存在精確的鎖時關系,而是以較慢的速度反映整體網絡活動[1]。受體也可位于突觸前,要么位于軸突末梢的突觸外膜上,要么位于突觸前網格上,由相同或相鄰的突觸扣結釋放出的神經遞質所激活。與神經遞質受體一樣,離子通道也位于神經元的樹突膜和軸突末梢上。突觸后通道通常在突觸輸入的融合與可塑性方面發揮作用,并通過介導緩慢的抑制性突觸反應,增強靜息膜電位,來控制神經元興奮。


                        集中于突觸前活性區或位于突觸扣結外膜的突觸前離子通道參與調節神經遞質的釋放,從而在神經元活動的突觸前調節中發揮作用。因此,很容易理解,同一受體和離子通道針對細胞的不同亞細胞區室時可以滿足不同的功能要求 [1]。


                        此外,膜蛋白激活對突觸融合與調節遞質釋放所產生的影響,主要取決于受體和離子通道在靶神經元區室的密度大小和功能耦合,膜蛋白激活對受體和離子通道相對于興奮性和抑制性突觸點所處位置的影響也是同理。因此,問題在于如何在高分辨率下精準確定這些分子的亞細胞位置。




                        先進的高分辨率免疫細胞化學方法

                        為此,下列先進的高分辨率免疫細胞化學方法已得到廣泛應用:

                        1

                        包埋前免疫膠體金法;

                        2

                        包埋后免疫膠體金法;

                        3

                        基于十二烷基硫酸鈉(SDS)的冷凍斷裂復型標記(SDS-FRL)技術。

                        (1)在包埋前免疫膠體金法中,一個0.8nm或1.4nm的金顆粒與二抗發生耦合反應,從而促進適當的滲透。隨后采用銀強化法,對金顆粒進行強化,生成大小足以被檢測的顆粒。


                        由于這種方法生成了非擴散性標記,因此可以確定發生反應的精確位置以及蛋白質在突觸外和突觸周圍所處的位置。然而,我們無法利用這種方法檢測突觸蛋白,原因可能在于固定組織的特化突觸結構中的抗原表位難以確定[2]。


                        (2)包埋后免疫膠體金法解決了包埋前技術存在的問題。該方法使免疫化學品與暴露在超薄切片表面的抗原發生反應,隨后采用與檢測非突觸分子相同的靈敏性檢測法來檢測突觸蛋白。這種方法還改善了蛋白質密度的定量評估。


                        但是,在樹脂包埋切片中,大量蛋白質掩藏,無法確定抗體,如此便限制了這種技術的檢測靈敏度[2]。


                        (3)在SDS-FRL技術中,我們先用高壓冷凍儀(徠卡EM ICE)對腦組織進行冷凍,然后使用復型儀(徠卡EM ACE900)對冷凍樣本進行冷凍斷裂。蛋白質會被分配到質膜的原生質面(P面)或外質面(E面)。將分子固定在薄碳層(3-5nm)上,再進行2nm厚的鉑/碳層鍍膜,遮住膜面,然后用15-20nm厚的碳沉積物強化這種材料[3]。與傳統的免疫膠體金法相比,SDS-FRL技術有兩個主要優勢。




                        首先,SDS-FRL技術的靈敏度大大高于包埋前和包埋后技術,因為膜蛋白暴露于復型品的二維表面(圖1),使其很容易接觸到免疫試劑。此外,SDS會使抗原表位發生變性,讓適合進行免疫印跡解析的抗體與固定在復型膜上的蛋白質發生相似反應。其次,我們可以同時觀察到突觸蛋白質和突觸外蛋白質,并且可以在膜段中實現免疫膠體金密度的量化。

                        1670929292726.jpg


                        圖1:利用SDS冷凍斷裂復型標記技術展示海馬細胞樹突中GABA(B1)和Kir3.2的分布和共定位分析。圖A:在一個假定錐體細胞的樹突軸(Den)和樹突棘(s)的表面上發現了GABA(B1)亞單位的免疫顆粒群(箭頭處)。圖B、C:Kir3.2(5nm顆粒;雙箭頭處)、GABA(B1)(10nm;箭頭處)和PSD-95(C中15nm)的雙重和三重免疫膠體金標記顯示,這兩種蛋白質在錐體細胞的樹突棘(B和C)中聚集,并與PSD-95(C)的免疫反應所指的谷氨酸能突觸相關聯。比例尺:200 nm

                        與其他方法一樣,這種免疫細胞化學法也有一定局限性。首先,我們很難識別標記的形態結構,因此,有必要使用標記蛋白,從而有助于識別經過斷裂的膜[6]。其次,我們無法預測膜蛋白會分離到P面還是E面:有些蛋白優先分到P面,如GABA(B1)、Kir3.2[4],或分到E面,如AMPA受體[5],而其他蛋白,如gluRδ2[6],則同時定位于兩個面。因此,進行定量研究應仔細檢查分子的分配。



                        綜上所述,這三種免疫細胞化學技術提供了關于蛋白質的細胞和亞細胞分布的補充信息,在高分辨率下對受體和離子通道在神經元突觸前后區的定位和共定位問題進行定性定量分析時,這些技術得到廣泛應用。





                        參考文獻

                        1. Farrant M, Nusser Z: Variations on an inhibitory theme: phasic and tonic activation of GABA(A) receptors. Nature Rev Neuroscience 6:3 (2005) 215–229.

                        2. Lujan R, Nusser Z, Roberts JDB, Shigemoto R, Somogyi P: Perisynaptic location of metabotropic glutamate receptors mGluR1 and mGluR5 on dendrites and dendritic spines in the rat hippocampus. Eur J Neuroscience 8:7 (1996) 1488–1500.

                        3. Fukazawa Y, Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Hagiwara H, Shigemoto R: SDS-digested freezefracture replica labeling (SDS-FRL), in: Handbook of Cryo-preparation Methods for Electron microscopy, eds. Cavalier A, Spehner D, Humbel BM; CRC Press, New York (2009) 567–586.

                        4. Kulik A, Vida I, Fukazawa Y, Guetg N, Kasugai Y, Marker CL, Rigato F, Bettler B, Wickman K, Frotscher M, Shigemoto R. Compartment-dependent colocalization of Kir3.2-containing K+ channels and GABAB receptors in hippocampal pyramidal cells. J Neuroscience 26:16 (2006) 4289–4297.

                        5. Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Watanabe M, Molnar E, Fujimoto K, Shigemoto R: Number and density of AMPA receptors in individual synapses in the rat cerebellum as revealed by SDS-digested freeze-fracture replica labeling. J Neuroscience 27:8 (2007a) 2135–2144.

                        6. Masugi-Tokita M, Shigemoto R: High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr opinion in Neurobiology 17 (2007b) 387–393.

                        7.Fujimoto K: Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Journal of Cell Science 108 (1995) 3443–3449.



                        微信掃一掃
                        版權所有©2024 北京佳源偉業科技有限公司 All Rights Reserved    備案號:京ICP備2021037741號-1    sitemap.xml    管理登陸    技術支持:化工儀器網    
                        人人操正在播放_亚洲欧美小视频_黄片欧美视频免费_91自拍偷拍网