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                        使用冷凍共聚焦顯微鏡定位活性循環核孔復合物(上)

                        更新時間:2023-08-30      點擊次數:254


                        圖像:冷凍FIB薄片——SEM和共聚焦熒光圖像的疊加。酵母細胞的靶結構(核孔蛋白Nup159-Atg8-split,紅色),用箭頭標記。比例尺:5µm[1].

                        本文介紹了如何利用冷凍光學顯微鏡,尤其是冷凍共焦顯微鏡來提高冷凍工作流程的可靠性。評估了EM網格和樣品的質量,并分析了目標結構的分布。本文展示了如何將冷凍共焦3D數據投射到SEM圖像上,將感興趣結構可靠地保留在FIB切割的薄片內,以便在冷凍TEM中進行進一步研究。




                        使用冷凍共聚焦顯微鏡定位核孔復合體

                        核孔復合體(NPC)是連接真核細胞核外膜和內膜的大的蛋白質組合體。NPC由幾百個核孔蛋白(NUP)組合而成,這些核孔蛋白形成一個中心通道,使分子能夠選擇性地進行核質運輸:RNA和核糖體蛋白質從細胞核運輸,而在細胞質中翻譯的核蛋白質、信號分子、脂質等則穿梭到細胞核中。


                        為了更好地理解NPC的結構-功能關系以及它們的生物發生和轉換的調節,以最高的分辨率在細胞內部環境下研究它們的結構至關重要。圖1顯示了核膜冷凍電子斷層照片的組分分割圖[2]。斷層照片顯示,蛋白酶體與NPC結合,“在細胞核和細胞質之間的通道上建立了蛋白質降解樞紐"(Albert,S.等人,PNAS,2017年12月)。這清楚地顯示了冷凍電子斷層掃描(cryo ET)提供有關細胞結構和分子社會學的見解的方式。但是,如何用冷凍ET選擇性地檢查發生頻率低的罕見特定細胞事件,例如經歷自噬的NPC?

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                        圖1:冷凍電子斷層掃描的部分區域,顯示出細胞核周圍的原生細胞環境。蛋白酶體在兩個不同位置與核孔復合物(紫色)相連(橙色:膜栓系蛋白酶體,黃色:籃狀栓系蛋白酶體,藍色:游離蛋白酶體)。圖中還顯示了核膜(灰色)、核糖體(黑色/白色)和線粒體(紅色,帶有一排排黃色ATP合成酶)。數據由德國馬丁雷德(Martinsried)生化研究所分子結構生物學部門B. Engel博士提供。原出版物:Albert S, Schaffer M, Beck F, Mosalaganti S, Asano S, Thomas HF, Plitzko JM, Beck M, Baumeister W, Engel BD.“蛋白酶體連接到核孔復合體的兩個不同位點"[2]。




                        冷凍電子斷層掃描

                        冷凍ET是一種專用的透射電子顯微鏡技術,該技術采集一系列傾斜圖像,并重建觀察區域的三維體積(圖2)。隨著EM硬件和軟件的最新進展,可以實現亞納米級的分辨率。為了使樣品盡可能接近原生狀態,應將其快速冷凍,以避免破壞性的冰晶形成。產生這種無定形冰的過程稱為玻璃化。

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                        圖2:冷凍電子斷層掃描技術示意圖。使用電子束(TEM)對樣本進行觀察,同時傾斜樣本,從不同觀察角度創建一系列圖像。3D立體容積得到重建,同時可對蛋白質的分布進行可視化觀察與分析。




                        冷凍FIB研磨

                        只有厚度低于300nm的標本才能通過冷凍電子斷層掃描直接評估。較厚的樣品,例如用于NPC分析的酵母細胞核,必須通過銑削過程進行打薄。專用雙光束顯微鏡包括掃描電子顯微鏡和聚焦鎵離子束(冷凍 FIB-SEM),用于燒蝕不需要的材料(圖3)。

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                        圖3:聚焦離子束銑削技術示意圖。使用掃描電子束觀察樣本,同時對樣本專門使用了聚焦離子束(FIB),以去除薄冰片(薄層)上方及下方的物質。

                        在銑削過程中,去除感興趣區域上方和下方的材料,以產生200–300nm厚度的薄片。通過FIB研磨,之前無法檢測的厚細胞標本部分現在可以用于冷凍ET。




                        低溫光學顯微鏡

                        為了獲得特定細胞部位(如正在經歷自噬的NPC)的斷層照片,必須在FIB研磨和冷凍ET期間確定感興趣的結構。由于在銑削之前或銑削過程中,大多數結構在SEM中無法清晰識別,因此需要一種在冷凍條件下可視化和定位感興趣分子的方法。


                        為了解決該問題,要使用冷凍熒光顯微鏡,例如使用THUNDER Imager EM cryo CLEM。使用基因編碼的熒光標記,可以可視化細胞中的特定靶點,并識別和標記感興趣的結構。接著,可以在后續的EM步驟中檢索圖像和xy坐標(圖4)。

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                        圖4:靶區劃定與檢索。冷凍光學顯微鏡和FIB-SEM中的熒光酵母細胞。左圖:酵母熒光圖片,其中顯示了紅色的核仁和綠色的細胞壁。核仁由十字線標記。右圖:在FIB-SEM中檢索相同的位置,以創建包含感興趣細胞核的薄片。此處還顯示了初始銑削階段。薄層上下研磨窗口(黑色區域)可見。比例尺:10µm。圖片由P.Erdmann博士提供;酵母種株由F.Wilfling創建。馬克斯·普朗克生物化學研究所,德國馬丁斯里德。

                        當然,顯微鏡硬件必須始終保持樣品玻璃化?,F代寬場顯微鏡系統使用非常靈敏的攝像頭,甚至可以檢測微弱表達的蛋白質。此外,通過應用最新的實時去除非焦面信號技術技術,可以解決寬場系統固有的難題,如離焦模糊。


                        然而,僅檢索感興趣結構的xy坐標是不夠的,z坐標也是必要的,以盡可能地使-靶結構包含在產生的FIB薄片中。然而,在寬場顯微鏡中,沿光軸的分辨率是有限的。


                        為了提高z分辨率,照理說下一步該選擇共聚焦。中間聚焦平面上的針孔會阻擋離焦光線,從而提高對比度和分辨率,尤其是沿z軸的對比度和分辨率(有關共焦原理的更多信息)。



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