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                        使用冷凍共聚焦顯微鏡定位活性循環核孔復合物(下)

                        更新時間:2023-09-18      點擊次數:323

                        使用共聚焦顯微鏡的三維定位工作流程




                        在下文中,描述了在3D冷凍共聚焦顯微鏡中識別熒光目標結構的工作流程,以及如何在冷凍FIB-SEM中檢索熒光目標結構,目的是以更可靠的方式將其保留在最終FIB薄片中,以便在冷凍TEM中進行進一步研究。




                        01

                        用于檢查網格質量和靶分布的成像技術概述

                        為了評估冷凍EM網格和樣本的質量,先創建一張相機概覽圖像。使用透射或反射顯微模式,可以看到載網碳膜是否完整(圖1)。

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                        圖1:EM網格——質量評估和靶分布。以A9細胞為例。左圖:通過反射成像觀察到的網格方格??梢妰蓚€玻璃化細胞;在細胞下方可以觀察到碳膜上的裂紋。中間圖:透射光下相同的網格方格。其它信息,如冰晶污染,變得可見。右圖:相同細胞顯示Alexa Fluor 488 Phalloidin以綠色標記纖維狀肌動蛋白(F-actin),細胞核以紅色用DAPI染色。3D成像堆棧的圖像投影。比例尺:10 µm.

                        同時,可以判斷有關細胞及其相對于網格方格的位置的信息。在隨后的EM步驟中,只能評估網格方格中心附近的目的細胞。為了改善細胞的定位,可以在將細胞接種到載網碳膜上之前應用微排布技術[3]。  


                        在下文中,基于未發表的圖像(德國海德堡EMBL的Herman Fung和Julia Mahamid提供)和《核孔的在細胞內的原位結構及其轉換的快照》中的數據[1],詳細解釋了3D冷凍靶向過程。


                        有關載網碳膜完整性的信息,以及熒光樣品在網格方格內合適的位置,有助于選擇合適的FIB研磨位置(圖2)。

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                        圖2:透射光模式和熒光模式的概覽圖像。具有表達核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus(紅色)和校準珠子(紅色,強信號,圓形,1µm)的酵母細胞。結合載網碳膜質量信息,可以確定FIB銑削的合適位置。綠色框表示以下步驟中使用的區域。載網旋轉調整為FIB視圖(見下文);比例尺:20 µm.




                        02

                        通過高分辨率共焦z堆疊獲得3D信息

                        在為FIB銑削選擇相關位置后,在這些位置沿光軸創建一系列熒光圖像以獲得3D信息。與普通寬場系統相比,要是想提高z方向的分辨率,共聚焦顯微鏡是方法。通過激光逐點掃描樣品,只記錄熒光發射的聚焦信息。然后,將在不同z位置記錄的2D圖像組合成3D堆棧(圖3)。

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                        圖3:共焦z堆棧的三維顯示。記錄了與圖2所示相同的網格方格。校準珠子在綠色和紅色區域中顯示出強烈的熒光,但仍然可以通過信號的強度和形狀進行區分。核孔蛋白Nup159-Atg8-split Venus僅以紅色顯示。后續FIB銑削的靶位置之一由放大框中的箭頭指示。

                        顯微鏡系統的軸向分辨率主要取決于所用物鏡的開啟角度(所謂的數值孔徑)。由于商品化冷凍顯微鏡為方便使用者而使用空氣物鏡(不需要浸入,可能會影響樣品的玻璃化狀態),因此實際分辨率有限。xy的典型分辨率為200 nm,z的分辨率約為800 nm。


                        為了能夠正確定位感興趣的細胞位置,可以將校準珠子作為參考結構應用于樣品,以便在3D中對齊和關聯熒光和EM圖像[4]。


                        典型的珠子尺寸為1µm,呈球形,這使其中心坐標能夠進行亞衍射擬合。通過SEM中的背散射電子,可以更清晰地觀察到含有金屬的微珠,從而將它們與大小相似的冰晶區分開來。優先選擇熒光發射光不同于實際目標結構的熒光發射光的珠子,以便能夠更好地區分(圖4)。

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                        圖4:坐標變換原理。使用基準點作為支撐點,將靶坐標從光學顯微鏡轉移到FIB-SEM。黃色:校準珠子;紅色:Nup159-Atg8-split Venus.左圖:共聚焦圖像的投影,圓圈標記示例性珠子和箭頭標記目標NUP。中心圖像:用相同珠子標記的SEM圖像。右圖:通過在兩種模式中疊加珠子信息創建疊加熒光信號和SEM信號的圖像。因此,目標位置被投射到SEM圖像中。比例尺:20 µm.




                        03

                        標記基準珠和靶

                        由于基準點在LM和SEM中都可見,因此它們的坐標可用于在兩種模式之間轉換旋轉、平移和縮放等參數。然后,可以將共聚焦顯微鏡中標記的靶坐標轉換為FIB銑削過程,以增加獲得FIB薄片中具有感興趣結構的概率。


                        然而,用于精確3D定位的商業軟件解決方案尚未開發,但基于上述出版物(3D Correlation Toolbox),有一個開源解決方案可用。


                        使用3D Correlation Toolbox,可以加載共聚焦圖像數據,標記靶和校準珠子,并自動確定其中心坐標。然后將定義的坐標標記投射到FIB圖像上,以定義銑削的xyz坐標(圖5)。




                        04

                        FIB研磨

                        為了將靶區域研磨成適當薄的體積,感興趣結構的上方和下方各設定一個銑削窗口,如熒光信號投射到FIB圖像上所示(圖5)。然后施加鎵離子束,并削除相應窗口中的材料??梢栽谝粋€EM網格上創建多個薄片,從而提高工作流的效率。

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                        圖5:熒光在FIB圖像上的投影,用于精密銑削。左圖:銑削前樣品的FIB視圖與共聚焦投影的疊加。箭頭表示靶NUP結構。黃色:校準珠子;紅色:Nup159.Atg8-split-Venus.中心圖像:在關聯共焦和FIB圖像之間的珠子位置后,在FIB視圖上疊加共焦圖像平面。箭頭表示下薄片上的靶結構。右圖:研磨后共聚焦圖像投影和SEM視圖的疊加。產生的薄片中含有目標結構熒光(見箭頭)。




                        05

                        冷凍電子斷層掃描

                        為了以分子分辨率獲得樣品的結構信息,使用冷凍透射電子顯微鏡對冷凍樣品薄片進行成像。通過在薄片的SEM和TEM視圖之間進行配準,可以根據薄片中包含的目標熒光信號確定傾斜序列采集區域。然后將成像的傾斜序列進行計算組合,以重建細胞內部的三維體積。通過對許多同類單個蛋白的結構信息進行平均(亞層析平均),可以獲得更好的大分子解析結構。在圖6中,圖5所示的下薄片由冷凍ET成像。斷層照片的分割結果顯示了核膜與靶NUP位置。

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                        結 語

                        本文表明,冷凍共聚焦顯微鏡是冷凍工作流程中的一個重要組成部分,用于評估EM載網上玻璃化樣品的質量和目標結構分布。在冷凍條件下記錄的高分辨率共聚焦數據使科學家能夠在3D熒光下定位感興趣結構。3D體積圖像可作為光電關聯的參考,以檢索FIB-SEM中的目標結構進行銑削,隨后在冷凍TEM中進行電子斷層掃描,以獲得目標結構在其原生細胞環境中的高分辨率圖像。





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