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                        冷凍透射電子顯微鏡的投入式冷凍:基本原理

                        更新時間:2023-10-11      點擊次數:372
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                        透射電子顯微鏡所需的高真空度(TEM)極大地減弱了研究自然存在于水相中的標本的能力:將“濕"標本暴露在遠低于水蒸汽壓的壓力下,將導致水相在柱中迅速沸騰,對標本的結構造成破壞性后果。因此,在常規TEM中使用了各種方法在檢查前干燥標本——這是一個準備步驟,通常與限制結果重要性的偽影有關。

                        冷凍透射電子顯微鏡


                        一種解決標本制備過程中干燥問題和顯微鏡真空中水分揮發性問題的方法是在-180°C及以下的特殊支架中,以低升華速率在冷凍狀態下檢查樣品。這項技術被稱為冷凍透射電子顯微技術(冷凍TEM)或透射冷凍電子顯微技術,在過去幾十年中已成為結構生物學中的工具,并且隨著冷凍電子斷層掃描的出現,在細胞生物學中也同樣不可少。


                        對于本質上足夠薄的樣品,如孤立的大分子復合物、病毒或小細胞,冷凍TEM的標本制備基本上可以簡化為一個步驟:通過沉浸式凍結(浸沒冷凍)物理固定。本文介紹了這種技術的基本原理和缺陷,并隨附一篇文章介紹了幾種最新的應用。

                        沉浸式凍結

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                        圖1:準備網格

                        成功可視化嵌入冰中的樣品的一個先決條件是,在短時間內將水分子固定在適當的位置,不允許形成冰晶,理想情況下會形成無定形凍結(玻璃化)水。在沉浸式凍結的情況下,只有使用具有高導熱性的合適制冷劑,并且快速浸入樣品以確保整個樣品快速冷凍,才能實現嵌入冰中的樣品的可視化。合適的制冷劑包括液化乙烷、丙烷或二者的混合物[1],使用溫度略高于熔點(分別為-183℃,純化合物為-188℃)。此外,標本內的任何一點到暴露于制冷劑的表面的距離必須短,即樣品必須非常薄。


                        冷凍TEM中的標本載體必須為標本提供良好的支撐,但幾乎沒有背景來進一步降低典型未染色冷凍樣品的低對比度。它們還必須導電,以避免標本帶電和相關問題,如漂移。所有這些要求在一定程度上都可以通過帶有穿孔碳膜的標準TEM網格(實驗室制造或商用)得到滿足。后者具有非常規則大小和位置的孔,便于自動數據采集??赡苄枰褂幂x光放電/等離子體清洗或基質蛋白涂層對網格進行預處理,以允許水溶液均勻擴散或細胞附著。


                        對于基本沉浸式凍結,用鑷子固定在類似切紙機的裝置中(圖1),涂抹少量(3–5µl)水溶液中的標本,并用濾紙吸干溶液的主要部分,以減少殘留層的厚度。這一步驟對于玻璃化(見上文)和達到顯微鏡電子束可穿透的厚度都是必要的,對于大多數樣品,無需采取進一步的制備步驟。精確的厚度取決于樣品和可用的顯微鏡,通常冰層要盡可能薄,但厚度不超過500nm.這也在所述技術可以有效凍結的厚度范圍內。


                        吸干后,立即將樣品迅速放入制冷劑中。冷凍后,樣品可以轉移到液氮中,在顯微鏡檢查之前幾乎無限期地儲存。




                        挑 戰

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                        圖2:徠卡EMGP半自動沉浸式凍結裝置

                        一個關鍵問題是通過足夠快的冷卻來生產玻璃狀冰,但也要將冰保持在這種無定形狀態:后者要求樣品保持在再結晶溫度以下??梢酝ㄟ^將網格保持在液氮以下或在冷氮氣氣體環境中,并預冷卻操作冷凍標本所需的所有工具達到目的。


                        另一個主要問題是冷凍標本的表面因濕度冷凝而受到污染,從而形成納米尺寸的冰晶。由于樣品將被冷凍成像并作為一個整體(與冷凍替代或Tokuyasu冷凍切片等通過后續處理步驟去除表面晶體的方法相比),這種污染將在TEM中作為高對比度特征而明顯,因此必須避免。這可以通過一些措施來實現,旨在降低周圍大氣的濕度和樣品暴露在該大氣中的時間:通常,最好是在除濕室,樣品應保持在液氮以下,必須避免在樣品表面呼吸,所有轉移應使用清潔工具在液相上方的干燥(和冷)氮氣環境中快速進行,顯微鏡必須通過特殊的防污染裝置在目標區域提供清潔的真空。


                        然而,即使是冷凍的樣品,如果在冷凍前的瞬間處理不當,也無法產生有意義的結果。問題的一個潛在來源是,如圖1所示,儀器上的標本溫度不受控制:位于含有液氮的容器上方的未定義位置,樣品可能暴露在室溫或冷氣體中,導致不良狀態。


                        在同一類型的儀器上,尤其是在上述推薦的濕度較低的房間中工作時,溶劑的蒸發可能會產生問題:根據[2],在室溫和30%的環境濕度下,水以50nm/s的速率從薄膜中蒸發。溶劑的去除以及隨后鹽類和其他溶質的富集顯然會嚴重影響從含水標本中獲得的結果。


                        盡管經驗豐富的研究人員可以使用圖1所示的基本工具取得非常有意義的結果,但上面提到的許多問題仍未解決。因此,實驗室已經開始建造自己的儀器,包括環境室和自動吸干器。隨后,不同制造商推出了商業產品(回顧請參見[3]),包括徠卡顯微系統公司與維也納IMP/IMBA電子顯微鏡設施合作開發的徠卡EM GP沉浸式凍結裝置(圖2)。




                        References:

                        1. Tivol WF, Briegel A, and?Jensen GJ:?An improved cryogen for plunge freezing. Microsc. Microanal. 14: 375–79 (2008).

                        2. Frederik PM, and Hubert DHW: Cryoelectron microscopy of liposomes. Methods Enzymol. 391: 431–48 (2005).

                        3. Dobro MJ, Melanson L, Jensen GJ, and?McDowall AW: Plunge freezing for electron cryomicroscopy in: Methods in enzymology 481: 63–82 (2010).



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